“国药动保”推荐阅读【国际瞭望】综述非洲猪瘟病毒
点击量:235时间:2019-09-27来源:猪业科学

“国药动保”推荐阅读【国际瞭望】综述非洲猪瘟病毒

原创: 刘颖昳(编译) 猪业科学 昨天

摘 要

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100%的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASF Virus,ASFV)引起,ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制,ASFV是Asfarviridae科Asfivirus属唯一的成员。ASFV的天然宿主包括野猪和Ornithodoros属的节肢动物媒介。ASFV在其储存宿主的感染通常是无症状的,并且发展为持续感染。相反,ASFV对家猪的感染可导致致命的出血热,目前且无有效疫苗。

 

确定ASFV毒力相关基因,以及探索病毒逃避宿主免疫应答的机制,公认为是影响疫苗开发的关键步骤。此外,病毒产物与宿主的相互作用与病毒复制紧密相关,为寻找防治该疾病的潜在靶标提供有效信息。

 

关键词:

非洲猪瘟病毒;基因表达;DNA复制;A179L

 

 1  简 介

 

非洲猪瘟是一种猪的病毒性疾病,可导致家猪的高死亡率,同时在天然的野猪储存宿主中表现为无症状。ASF导致重要的经济损失,在缺乏有效疫苗的情况下几乎无法避免,目前的疾病控制方式主要是对感染地区的隔离检疫和对受感染猪只的扑杀。ASF由ASF病毒引起,这是一种具有复杂分子结构的双链DNA病毒。ASFV是Asfarviridae家族中唯一的成员,也是唯一由节肢动物(Ornithodoros属的软蜱)传播的DNA病毒。软蜱(Ornithodoros moubata)参与非洲猪瘟病毒和欧洲O.erraticus的丛林传播循环。与家猪有相似急性症状的野猪似乎与ASFV在欧洲的传播周期相关。

 

这种病毒引起的疾病最早是20世纪20年代在肯尼亚发现。随后即被局限在非洲,直至20世纪中期蔓延到欧洲,后来扩展到南美洲和加勒比地区。20世纪90年代,欧洲通过严格的控制和根除计划(撒丁岛除外)净化了这种疾病。然而,在2007年,ASFV再次从非洲蔓延到高加索地区,特别是格鲁吉亚,并在2014年到达欧盟的东部领土。越来越多的欧盟国家,波兰和3个波罗的海国家开始报告这一疾病的发生,最近是在摩尔多瓦。由于缺乏具有保护功效的疫苗,ASF对所有欧洲国家都构成严重威胁。

 

ASF在非洲东部和南部的传播已经证实了其流行复杂性,ASFV具有22种基因型,主要基于编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因的C末端区域的序列变异特征来区分。最近,报道了一种新的基因型,即基因型XXIII,具有基因型IX和X的共同祖先,由东非国家和刚果共和国流行的分离株组成。文章总结了ASFV的现状。

 

 

2  非洲猪瘟病毒

 

ASFV是一个较大的具有包膜的病毒,具有二十面体形态,平均直径为200nm。病毒基因组由单个线性、共价封端的双链DNA组成。不同分离株的基因组长度在170~190Kbp之间变化,编码151~167个开放阅读框。ASFV复制主要是在细胞质,但细胞核也是早期病毒DNA合成的部位。邻近病毒基因组开始复制部位的薄层网络发生分解,以及多种核蛋白重新分布,均表明在病毒感染期间存在调节细胞内核的复杂机制。

 

病毒基因的转录受到有力地调控。目前,已经通过独特的积累动力学,包括早早期,早期、中期和晚期(immediate–early,early,intermediate and late)转录产物来确定四类mRNA。早早期和早期基因在DNA复制开始之前表达,而中期和晚期基因在之后表达。中期基因的存在说明存在级联模式可调节ASFV基因的表达。病毒从部分未包被的核心颗粒进入细胞质,使用包装在病毒颗粒中的酶和其他因子,之后则立即表达出DNA复制所需的酶。病毒在病毒工厂和DNA复制的主要晚期完成形态建立。

 

 

3  病毒粒子结构

 

ASFV颗粒具有由几个同心结构域组成的二十面体形态:由中心基因组形成的内核包含核仁,其被称为核壳的厚蛋白质层包覆;然后是围绕内核的内部脂质包膜;最后是衣壳,这是细胞内病毒粒子的最外层。细胞外病毒颗粒具有额外的外部包膜,当病毒通过质膜出芽时产生。然而,这种包膜对病毒感染并非必要,其重要性尚不清楚。

 

 

4  病毒进入机制

 

ASFV感染周期始于病毒吸附和进入宿主细胞。对于ASFV进入机制的早期研究将此事件描述为低pH和温度依赖性过程,与Vero细胞和猪巨噬细胞中可饱和及特异性受体介导的内吞作用一致。然而,该病毒的受体仍然未知。ASFV的有限细胞嗜性表明感染需要巨噬细胞特异性受体。ASFV对猪巨噬细胞和单核细胞的感染与CD163清道夫受体的表达相关,这是巨噬细胞成熟的标志之一。之前有报道提出这是一种可能的病毒受体,因为针对这一分子的单克隆抗体能够阻断原发性肺泡巨噬细胞的感染。

 

然而,最近的研究表明CD163不是感染Georgia2007/1病毒分离株所必需的受体。使用CRISPR/Cas9系统得到的将CD163基因完全敲除的基因编辑猪显示,临床症状、死亡率、病理学或病毒血症没有差异。这些研究的一个结论是虽然CD163可能是必需的,但对于感染而言还不足够,其他巨噬细胞表面蛋白也可能参与感染过程。

 

虽然目前有证据支持受体依赖的病毒进入机制,例如网格蛋白介导的动力蛋白依赖性内吞作用,但是也有证据表明ASFV还可利用其他机制,如吞噬作用和巨噬细胞增多症。此外,胆固醇是ASFV成功进入所必需的。当使用适合该细胞系的病毒分离株时,这些机制在巨噬细胞靶细胞和Vero细胞中均可发生。

 

此外,一些ASFV蛋白参与了进入机制,如p30,对病毒内化很重要,而其他蛋白如p12和p54经鉴定为潜在的病毒附着蛋白。

 

 

5  ASFV进入内体通路

 

ASFV感染最终应到达内吞途径。一旦病毒进入内吞途径,其必须通过不同的内吞体群体才能实现成功感染(图1)。

内吞途径的成熟受到募集到内体膜的蛋白质和脂质精确调控。Rab GTPase蛋白家族是内吞成熟途径的主要调节因子,其中Rab家族的每个成员特异性定位在不同的内体区室。吸附后的几分钟内,在用Rab5和EEA1标记物标记的早期内体(early endosomes,EE)中发现了入侵病毒。事实上,完整的衣壳化病毒粒子只能在EE水平上发现,而在其他成熟的酸性区室中却没有。用bafilomycin A1抑制内体酸化可以阻止病毒的脱衣壳作用,但是只有在这种情况下,才有可能在CD63阳性的多泡内体和表达Rab7的晚期内体中观察到完整病毒。在正常情况下,晚期内体内仅有缺乏衣壳蛋白的病毒内核。

 

其中涉及发动蛋白和网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用。仅几秒钟即可通过内吞途径进展并到达成熟的内体区室,在这里会发生病毒脱衣壳和内部病毒薄膜与内体膜的融合。新合成的病毒体在病毒工厂中组装,并通过胞质膜上的胞吐作用或通过形成凋亡小体离开细胞。

 

在感染后30~45min之间,在成熟内体区室中的酸性腔内发生病毒脱衣壳。成熟的内体区室是表达CD63的多泡体,其特征在于存在管腔内囊泡以及表达Rab7的晚期内体。对于其他病毒,连续病毒脱壳和穿透也对内体成熟具有依赖性。一旦脱壳,病毒颗粒暴露内包膜,允许其相互作用,随后将该病毒膜与内体的限制性膜融合,并且裸露内核可以释放到细胞溶质中开始复制。这一过程强烈依赖于内体膜上的胆固醇流出。事实上,在这一水平上阻断胆固醇转运会导致病毒颗粒滞留在内体内,从而抑制感染进展。内包膜病毒蛋白pE248R也参与病毒融合。该蛋白与痘病毒进入/融合复合物的某些成员具有序列相似性。

 

其他内体成熟抑制剂,如渥曼青霉素(wortmannin),一种阻断早期内体融合的磷脂酰肌醇3(phosphatidy linositol 3,PI3)激酶抑制剂,以及扰乱微管依赖性内体转运的抑制剂诺考达唑也可预防ASFV感染。

 

 

6   ASFV基因表达和DNA复制

 

进入的ASFV粒子应当到达其在靠近微管组织中心(microtubule organizing center,MTOC)的核周区域的复制位点。早早期和早期基因在DNA复制开始之前表达。两条DNA链都是用作编码链的替代品,这可能是通过包装在病毒核心中的参与病毒转录的多种酶的作用来实现。DNA复制后,开始进行中期和晚期基因的转录。ASFV基因组约占其mRNA转录和修饰所涉及的基因的20%。这种转录机制使ASFV与宿主相对独立,并对其基因表达进行精确的时空调控。

 

虽然核在病毒复制中的确切作用仍不清楚,但已经通过原位杂交和放射自显影在感染细胞的切片中确定了ASFV的DNA复制中核阶段的存在。在碱性蔗糖梯度中进行复制病毒DNA的沉淀分析,结果显示在病毒DNA复制的早期,小DNA片段在细胞核中被脉冲标记,而较大的分子在细胞质中于后续时间内合成。在ASFV感染的细胞的细胞核和细胞质中合成的复制中间体由头对头的多联体组成。细胞核可能提供引发病毒复制所需的小转录子或其他因子,或者应该发生病毒DNA复制的早期阶段。

 

 

 7  ASFV和凋亡

 

ASFV感染后的ER应激反表现为caspase12的激活,其与线粒体caspase9和效应caspase3的激活具有相似的时间动力学。细胞凋亡是一种重要的预防病毒感染的先天细胞机制,多种病毒已经进化出对这种细胞反应的抑制或延迟策略。因此,ASFVA179L基因编码抗凋亡的Bcl-2蛋白的同源物,以延长宿主细胞存活,直到病毒基因组的复制完成。这种病毒Bcl-2在感染后的早期和晚期都有表达,并抑制多种促凋亡的BH3-only蛋白的作用,已知其为细胞凋亡的快速诱导因子,例如激活的Bid,BimL,BimS,BimEL,Bad,Bmf,Bik,Puma和DP5。

 

另一种ASFV基因——A224L,编码已知为IAP蛋白的凋亡抑制剂家族成员,能够抑制半胱天冬酶活化并促进细胞存活。病毒性IAP不仅可以阻断caspase-3活化,还可以激活NF-κB。有趣的是,该病毒编码一种干扰NF-κB活化的IκB样分子(A238L)。A238L和A224L在ASFV感染期间的不同时间表达,这表明ASFV在感染早期需要相对低的NF-κB活性以避免免疫应答,但是在后期需要较高活性,可能在细胞系统被滥用时阻止细胞的凋亡。在ASFV感染的最晚阶段,受感染的细胞经历凋亡,并且显示程序性细胞死亡的特征形态变化,包括受感染细胞发生典型的膜起泡,形成许多含病毒的囊泡,这可能一个有效的病毒传播体系。

 

 

8  ASFV和自噬

 

A179L是非洲猪瘟病毒的病毒Bcl2同源物,不仅与促凋亡的Bcl2家族蛋白相互作用以抑制细胞凋亡,而且通过其与BH3同源结构域的Beclin 1相互作用抑制自噬。与其他DNA病毒一样,ASFV有抵消自噬清除作用的防御体系。其中一个例子是HSV-1 ICP34.5蛋白,可通过与Beclin1的作用来抑制自噬。ASFV编码与ICP34.5同源的蛋白质,从而发挥其他功能。ASFV DP71L抑制激活PP1/蛋白磷酸酶1的ER应激反应。然而,与HSV-1 ICP34.5相反,其不会与Beclin1发生相互作用。

 

事实上,ASFV感染不会在Vero细胞中诱导LC3活化或自噬体形成。自噬是相关的细胞防御机制,其允许细胞组分的有序降解和再循环。自噬消除细胞内病原体,并且对先天性和适应性免疫应答具有至关重要的作用。一些DNA病毒,例如ASFV和HSV-1,已经进化出控制这种细胞反应的策略,以防止新组装的病毒颗粒的降解。相反,据报道大多数RNA病毒在感染细胞中诱导自噬,并且在一些情况下自噬可以促进病毒复制。

 

 

9  ASFV逸出细胞

 

成熟的病毒颗粒通过微管介导的机制从病毒工厂转运到细胞表面,取决于运动蛋白常规驱动蛋白和衣壳蛋白pE120R。一旦进入细胞表面,粒子就会通过在膜上出芽而离开宿主细胞,从而获得额外的包膜。细胞内和细胞外病毒都具有感染性,但结构和抗原性不同,这可能对宿主对ASFV的免疫反应具有重要意义。

 

 

10  潜在的疫苗和抗病毒药物

 

之前针对ASFV疫苗的开发尝试均未能诱导保护性免疫。目前,有几项基于减毒活ASFV(live attenuated ASFV,LAV)的实验疫苗可引发保护作用,其中包括在基因组中敲除单个或多个基因等方法,包括DNA疫苗。其中一些有希望能转化为成功的候选疫苗。如今,可用的疫苗应当满足多种要求。任何候选的ASFV疫苗都应包括可用于区分受感染或接种疫苗动物的标记,以便进行诊断。而且,由于缺少可支持减毒疫苗病毒复制而不改变病毒毒力的细胞系,疫苗生产尚无法进行。目前,野猪被发现是波罗的海和波兰非洲猪瘟传播的主要参与者。因此,针对这些动物的诱饵活疫苗对于限制疾病传播至关重要。在目前的情况下,疫苗可以与感染检测一同进行,以实现对该疾病的净化。现有的诊断方法可以实现病毒检测,同时也可检测抗体,以鉴别幸存者和无症状携带者。

 

在有效疫苗开发出来之前,依然存在使用抗病毒药物的可能性。抗病毒策略已广泛应用于人类感染,也可用于动物健康领域。抗病毒药物也可用于在暴发后对病毒传播进行早期控制。此外,抗病毒药物与疫苗接种方案的组合可用于引发免疫应答,从而有效预防疾病。在这里,我们已经对潜在的分子靶点进行了综述,其均可作为抗病毒的目标位点。

 

针对ASFV的抗病毒药物包括白藜芦醇和氧化白藜芦醇,微藻,胆固醇降低类药物或胆固醇转运抑制剂,抗肿瘤月桂基—没食子酸酯,抗惊厥丙戊酸,发动蛋白抑制剂,氟喹诺酮类,丝氨酸蛋白酶抑制剂,特异性多肽等。这些药物可以最终应用于快速反应,以减少易感动物,以便在暴发周围创建“安全区域”,从而控制感染的传播。

 

 

 

原文信息:Galindo I,Alonso C.African Swine Fever Virus:A Review[J].Viruses,2017,9(5):103,P1-P10;

原文作者:Inmaculada Galindo和Covadonga Alonso*

 

本文选自《猪业科学》2019年第9期“国际瞭望”栏目:P18-20(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。阅读更多内容可见网站:http://www.csis.cn。

·月刊杂志《猪业科学》网站 版权所有 备案序号:京ICP备09074008号-1
·联系地址:北京市朝阳区望京东路8号锐创国际2号楼1012室
·编辑部热线:010-84177146  010-84177148 转 稿件查询-608 杂志订阅-602 市场部门-601
·电子信箱:swineonline@263.net 传真:010-84177146转603 广告热线:010-84177146 联系人:15606133910
·国内外发行 津工商广字:120103400121