法国诗华”推荐阅读【主题策划】浅析猪精液常温保存技术的研究现状
点击量:0时间:2020-06-24来源:猪业科学

原创 李井春,李琦等 猪业科学 昨天

 



 

摘要

  为了更好地将常温保存的猪精液最大限度地利用,提高猪人工授精的效率。文章结合团队近些年的研究成果,介绍了猪精液常温保存的原理,影响猪精液保存的物理因素、微生物因素,精液稀释方法以及精液稀释液成分等,对提高猪精液常温保存的质量和延长保存时间提供技术支持,为将来猪精液低温保存,乃至冷冻精液保存技术的发展和完善提供参考和帮助。

关键词

公猪;精液;常温保存;精液质量

 

1  猪精液常温保存的原理

  猪精子质膜的磷脂分布的不均匀,低温会造成精子的冷休克现象。在2011年1月1日实行的《猪常温精液生产与保存技术规范》(GB/T25172-2010)中定义猪的常温精液为:经稀释后在16~18℃下短期保存,仍具有受精能力的精液。国家相关技术规范的制定有利于猪精液常温保存技术的发展与应用。Zou等(2000)研究发现猪新鲜精液在15℃和20℃保存效果较好。崔茂盛等(2018)研究发现猪精液在4℃保存时,使用实验室自研保存液,在10d后精子的活力依然可以达到70%。潘越博等(2010)研究发现猪精液在17℃下保存取得了良好的保存效果,其主要原因是猪精子在该温度下代谢速率变慢,使得其受代谢产物的影响变小,同时合适的温度可以避免低温对于精子质膜的伤害。

   稀释液作为猪精液保存的重要组成部分,具有为精子供能、维持内环境稳定、抗氧化、维持pH和避免微生物污染等功能。林峰等(2012)研究发现适当的降低精子保存环境中的pH比中性环境更有益于延长精子的保存时间,这是因为适宜的酸性环境可以有效降低精子的能量消耗。以此为基础,在精液稀释粉中加入适量酸性物质,调整精子所处的内环境,可以达到延长精子保存时间的目的。而稀释液中的其他成分如缓冲剂、悬浮剂和糖类等,则是模拟精清的成分以维持精子内环境稳定、防止精子沉积和为精子供能。为了进一步地延长精子的保存时间,减小微生物对于精子保存的影响,除注意操作流程的规范外,还要添加部分的抗生素。随着我国中医药学的发展,部分中药提取物开始逐步应用于精液保存,来替代抗生素,以减小细菌的抗药性。除中药外,抗菌肽在精液保存上的研究也有报道,在未来可能会有更好更高效的抑菌药物应用到猪精液保存中。

 2  影响猪精液常温保存物理因素

  猪精液的常温保存常受到温度、pH、渗透压等因素的影响。由于猪精子独特的质膜特性,其对冷冻和低温刺激极为敏感。低温会导致猪精子产生冷休克现象,冷休克能降低精子运动速度和精子活力,且这种现象是不可逆的。Lozaron等(1998)确定了猪精液的临界冷休克温度为12℃。Zou等(2000)发现在精液稀释前将精液置于室温或20℃条件下数小时,可以使精子对低温产生一定的耐受能力,这对延长精子的保存时间、保证精子的存活率和顶体的完整性有一定积极作用,但其机理有待进一步研究。通过相关学者不断地摸索与研究,逐渐确立15~20℃为猪精液常温保存的最适范围,而16~18℃在生产中应用最为普遍。当猪精液在较高温度下时,其质量与精子质膜上的热休克蛋白有关,温度低于12℃或超过20℃则会降低精液的保存时间以及精液的品质。未稀释的新鲜猪精液的pH在7.2~7.5之间,适当的低pH可以降低精子的代谢和运动水平。在猪附睾内精子可以存活30~60d,这与附睾内环境呈弱酸性(6.2~6.8)有很大的关系。猪精子的渗透压在290~300mosM,可耐受的渗透压为240~380mosM。精子可以在附睾中存活较长的时间,还与附睾中的渗透压偏高有关。附睾中的渗透压为400mosM,使精子发生脱水现象,导致精子缺乏运动所需最低水分,使得精子不能运动,但在体外条件下精子却无法承受这种高水平的渗透压,这可能与精子是否获能以及精子膜上的胞质小体有关。稀释液的离子浓度对维持渗透压没有太大的作用,但离子浓度过高会造成精子表面蛋白溶解和脱落,给精子造成损伤。目前,研究团队通过物理调节精液保存压强的方法,如负压条件对猪精液常温保存效果的研究结果表明,-0.04MPa的压强显著延长精液保存时间和提高精液保存的质量。从实际效果上负压保存降低了精液的稀释液中氧含量,降低精子代谢活动水平,减少精液中过氧化氢的含量。

 3  影响猪常温精液保存微生物因素

  在精液的体外保存过程中不可避免会受到细菌等微生物的影响。猪精液常温保存稀释剂中一般含有葡萄糖,其作用是为精子的生命活动供能,但在精液常温保存的温度条件下葡萄糖同样也会被绝大多数微生物所利用,其作用方式包括竞争营养物质导致精子活力下降、含有凝集因子使精子聚集、降低环境渗透压造成顶体肿胀以及无氧发酵使糖分产酸,从而导致pH降至酸性(5.7~6.4)等。一般排除特殊环境的影响,精液中的微生物主要以大肠杆菌和少量的葡萄球菌属和丝状真菌为主。大肠杆菌等革兰氏阴性菌对精液保存的影响较大,会造成精液质量下降。实际上,除从健康公猪采集精液时其生殖器所携带的细菌外,大部分细菌来自于采精室以及采精人员。另外在精液稀释时,也存在使细菌含量增加的潜在危险因素,比如敞开的采精杯、调整稀释液温度、运输和储存过程靠近空气压缩机部分表面高温等等都会造成精液质量的下降。除了动物来源的细菌外,非同源性细菌也越来越受到人们的关注。最近的一项研究显示,2010—2011年期间,在24个欧洲人工智能中心收集的344个猪精液样本中,有26%的精液被检测出细菌污染。检测出21种不同的革兰氏阴性菌,其中18种菌对常用抗生素表现出耐药性。这些细菌大多是与人类和动物感染相关的病原体,研究指出了细菌传播到精液中的潜在危险。值得注意的是,受污染猪精液中的细菌有4.5%来源于原精液,这表明大部分细菌来源于采精后的环节。当多种微生物污染精液时,精子活力会严重下降,有效保存时间会缩短,使用这样的精液进行人工授精会产生严重的不良影响。

 4  常温保存的猪精液的稀释方法

  常温保存猪精液产品的国家标准(GB/T25172-2010)为:地方品种剂量为40~50mL,其他品种剂量为80~100mL,精子活力均要≥60%。每剂量中直线前进运动精子数:地方品种≥10亿,其他≥30亿。稀释后精液的质量取决于稀释液的优劣和操作是否合乎标准。因此,在进行猪精液的稀释操作前要保证操作环境的干净和公猪的健康。采集精液前要使用双蒸馏水配制稀释液,置于水浴锅中进行加热搅拌处理。稀释液温度必须与精液温度相同,之后再进行稀释,以精液温度为准来调节稀释液温度,精子对于温度非常敏感,精液稀释过程中温度的变化对精液质量有着深远的影响。在精液的稀释过程中如果原精液的密度过大,应进行二次稀释防止稀释效应的发生。如果稀释的比例过大会导致保护精子的部分活性物质密度下降,其中不少是抑制精子获能成分。此外,稀释比例过大还会导致精子内部阴阳离子失衡使精子表面带电增多,使精液保存效果下降。稀释比例过小则会导致精子后期供能不足。合理的稀释比例不仅可以为精子提供合适的内部环境,也在一定程度上延长了精子的保存时间。JianDu等(2015)研究证明原精液与稀释液用1:1~1:4的体积比进行稀释时可抑制精子的早期获能,延长精液的保存时间。稀释后的成品猪精液需要一段时间来进行缓慢降温,如果精液冷却得太快,这将导致脂质与蛋白相分离,从而改变膜蛋白和膜通透性。稀释后的精液须避光保存,防止精子受阳光照射死亡以及震动造成的断尾。每12h缓慢摇匀一次,防止精子的凝集效应。稀释后的精子的活率会随保存的时间增长而逐渐下降,应尽早完成输精操作,提高精子的使用效率和母猪受胎率。

 5  常温保存的猪精液稀释剂成分的研究现状

5.1  供能物质

  糖类是生物界最广泛的供能物质。糖类具有价格低廉、易采购的优点,因此稀释液中添加葡萄糖、果糖或者海藻糖在猪精液保存中得到了广泛的应用。猪精子常温保存过程中因其自身的代谢,需要不断的消耗能量,而糖类是其能量的主要来源。此外糖类物质还具有维持渗透压、参与膜上物质的转运以及作为部分蛋白的功能基团等功能,故在不同的猪精液稀释液配方中常添加葡萄糖、果糖或者海藻糖。海藻糖不仅可以作为供能物质,也可以作为精子的质膜保护剂和抗氧化剂。高建明等(2007)研究证明在精液稀释液中添加适量的海藻糖可以提高精子的活率,并降低精子的畸形率。除上述几种糖外,乳糖也得到了部分应用,乳糖作为一种还原性二糖,能够作为抗氧化剂进行使用。商品猪精液稀释粉分为短效稀释粉和长效稀释粉,除其添加物不同外,添加葡萄糖的比例也存在差异。有研究表明,猪精液保存时间的长短与含糖浓度有关,低糖浓度的稀释液更有利于精液的保存。王雪晗等(2017)研究表明乳糖较其他糖类可以在猪精液的冷冻保存中更好地保护精子的质膜不受损伤。

5.2  缓冲剂

  为了保持精子内环境的稳定并防止其代谢产物影响稀释液的pH,需要在稀释液中添加缓冲剂。目前常用的缓冲剂主要有Hepes、Tes、Mops、Tris、NaHCO3和柠檬酸钠等。猪新鲜精液的pH为7.2~7.5,一系列的研究证明,偏酸性的环境有利于精子的保存。在稀释液中添加NaHCO3、柠檬酸钠等缓冲剂有利于平衡精子和细菌的代谢产物,维持一个动态的相对平衡的酸碱环境,以防止因保存液的过度酸化而导致精子的活率下降等问题的发生。当精液保存液的pH为5.7~6.4时,精子的顶体发生异常的概率会增加。除上述的缓冲剂外,一般还会在保存液中添加一些具有金属螯合能力的两性缓冲剂,如Hepes等。一些离子对精子的存活和功能是必需的,较低浓度的K+可维持精子膜上Na+-K+泵运转,使胞内K+浓度大于胞外,生产ATP维持精子的存活和运动,因此在稀释液中添加KCl可防止精子耗尽K+而丧失运动能力。还有一些离子不利于精子保存,如有缓冲作用的HCO3-,若过量就会使精子质膜结构改变,使质膜不稳定诱发获能,因此需要控制其浓度。Ca2+跨膜流入胞内会启动精子获能,引起顶体反应,这对完成受精是必需的,但对保存却是不利的。因此,配制稀释液常用去离子水,并加入EDTA等用来鏊合Ca2+和有害重金属离子。

 5.3  抗生素

  为了延长精液的保存时间,人们在精液的稀释液中添加不同种类的抗生素如青霉素、链霉素等,一般青霉素钠的添加量为0.6g/L,硫酸链霉素的添加量为1g/L。添加抗生素可以杀死或抑制有害细菌,延长精液的保存时间,提高受精能力。但是,随着抗生素的广泛应用,细菌耐药性不断增强。青霉素在稀释精液中12h后效价降低50%,精子保存时间和效果均无法达到理想效果。可见,过去常在精液稀释液中添加的青霉素和链霉素已无法有效抑制细菌微生物生长繁殖。随着青霉素在稀释精液中作用的减弱,不断有学者开发新的抗生素。由于磺胺类抗生素的抗菌谱较广,毒副作用轻,对常见细菌、螺旋体和某些放线菌均能表现出抑制作用,被广泛应用于畜牧生产各环节。其他种类的抗生素还有恩诺沙星、阿奇霉素、林肯霉素,氨苯磺胺等,但有关各种抗生素在稀释精液中的抑菌效果还有待进一步研究。

  精液保存液中的细菌会使稀释液的pH下降、精子更易发生凝集、顶体发生异常的情况,并在保存的第2天就有所表现,从而降低精液的保存时间。输精后会导致母猪的返情率升高,阴道内分泌物增多,增加母猪阴道的感染几率,从而增加母猪的淘汰率。由于抗生素的不正确使用,导致细菌的耐药性不断增强,所以急需研制一种抗生素的替代品,这种替代品不会使细菌产生耐药性,因此抗菌肽进入了人们的视线。有研究发现,在BTS保存液添加低浓度的环状六肽较使用抗生素的对照组效果要好,并且将添加低浓度环状六肽的精液输入到母猪的子宫内,其受胎率不会受到影响。发现这种环状六肽可以补充或替换稀释液中的抗生素。除抗菌肽外,聚维酮碘在猪精液稀释液上的研究也取得了一定的成果。众所周知,聚维酮碘作为一种广谱杀菌剂常被应用在水产养殖中。郑亚妮等(2015)研究发现按1∶100稀释使用的聚维酮碘可以提高精液的保存质量,在杀灭稀释液中大量细菌的同时并不会对精子产生毒害作用。中草药是中华医学界的瑰宝,中草药的许多成分对细菌有很好的杀灭作用。侯震坤等(2017)研究发现在常温保存精液中添加中药提取物淫羊藿可以取得很好的抑菌效果,同时减少精子的氧化损伤。谢东淇等(2017)研究发现常温精液中添加适量的茶多酚同样也可以取得较好的抑菌效果。我国中草药资源丰富,有很多中草药抑菌剂已广泛的应用在水产养殖中,但其在猪精液抑菌剂上的研究较少。如夏枯草、石榴皮、黄连、白头翁和乌梅等,这些具有良好抑菌效果的中草药在猪精液保存方面的有待进一步研究。

5.4  抗氧化剂

  在精液的常温保存过程中,精子呼吸代谢会产生活性氧族(Reactive oxygen species,ROS),低浓度的ROS有利于提高精子的活力以及受精能力,但高浓度的ROS会造成精子脂质的过氧化(Lipid peroxidation,LOP),改变精子质膜的通透性,这会降低精子活力以及受精能力。在猪精液保存的后期精子活力以及受精能力下降幅度较大,这是因为精子质膜上的不饱和脂肪酸不断氧化,所产生的氧自由基超出了稀释液中抗氧化物质的含量,使精子的膜功能造成了不可逆的损伤。所以常在精液的稀释液中添加抗氧化剂成分来保证精子的活力以及受精能力。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种三肽化合物,可以抑制质膜上脂质的过氧化。维生素B12、维生素E、维生素C、过氧化氢酶、甲基黄嘌呤、超氧化物歧化酶、半胱氨酸、丁羟甲苯、褪黑激素、大枣多糖和葡萄籽原花青素,也都具有抗氧化的作用。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase from micrococcus hemolyticus,CAT)是目前在猪精子保存中最常用到的且最重要的两种清除氧自由基的酶。任俊玲等(2012)研究表明,在猪冷冻精液稀释液中同时添加100IU/mLSOD和200IU/mLCAT可以明显增强解冻后精子保存效果。有研究表明,在猪的精液稀释液中添加1mmol/L的谷胱甘肽对精液有较好的保护效果,而添加1mmol/L和5mmol/L的维生素E对精液常温保存效果有害。而添加400μmol/L的维生素E可以显著降低保存4d精液中丙二醛(MDA)的含量。在猪精液的稀释液中添加适量的褪黑素可以提高精液的抗氧化能力和精子运动学参数,保护精子质膜、顶体和DNA完整性,提高精子的受精能力。海藻糖可以在精子的细胞膜外形成一层保护膜,从而保护质膜被氧化。同时,海藻糖还具有稳定细胞膜蛋白质的作用。胡建宏等(2006)研究发现海藻糖在极冷环境下可以保护精子的质膜,在常温下对精子的质膜同样能起到保护作用,该配方通过添加1g/L海藻糖,使保存7d精液的顶体异常率由原来的20%下降到11%。高建明等(2016)在自己设计筛选的100mL稀释液中额外添加0.15g海藻糖,显著提高了精液的保存时间,其保存效果要优于添加维生素B12组。精子长效稀释液中添加GSH可以有效降低精子代谢活性以及保护精子质膜完整性。

5.5  其他保护成分

  牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是一种蛋白类保护剂,具有稳定精子结构、中和精子有害代谢产物、维持精子运动及减少精子凝集等多种功能,从而起到延长精液保存时间、提高保存后精液的受精能力的作用。在精液稀释液中添加4mg/mL的BSA,其精液的保存效果最好。但BSA在较高浓度下会导致精子的获能,所以添加时要控制其用量。

   中草药作为我国医药的瑰宝在猪精液的保存方面也有一定的应用。范晓腾等(2016)发现在猪精子常温保存和降温过程中白藜芦醇对精子具有一定的保护作用,能够清除猪精子内的活性氧自由基,减弱氧自由基对精子的损伤,提高精子的品质。在常温保存中最佳保护浓度为50μmol/L。芝麻酚作为一种新型的抗氧化剂可以提高精子的抗氧化能力,提高冷冻后精子的DNA完整率。茶多酚是茶叶中的主要成分之一,其具有较好的抗氧化能力。谢东淇等(2017)研究发现在猪精液中添加0.04g/L的茶多酚(Tea'spolyphenol,TPP)不仅可以提高猪精液的保存质量,同时也可以降低精液中的细菌含量。此外,茶多酚还可以与壳聚糖联合使用对精液中的大肠杆菌起到杀灭的作用,同时也可以提高精子的抗氧化能力。但由于许多中草药的成分并不明确,以及添加剂量可能随草药产地的不同而不同,所以具体的应用还有待进一步的研究。但随着科技的发展以及中草药低温萃取技术的不断完善,相信在不久的将来中草药将发挥越来越重要的作用。

   综上所述,通过对猪精液常温保存的原理、影响猪精液保存的物理因素、微生物因素、精液稀释方法以及精液稀释液成分等研究现状的分析,对提高猪精液常温保存的质量和延长保存时间提供技术支持,可为将来猪精液低温保存,乃至冷冻精液保存技术的发展和完善提供参考和帮助。

 

本文选自《猪业科学》2020年第6期“主题策划”栏目:P50-53(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。阅读更多内容可见网站:http://www.csis.cn。

 

 

 

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