“法国诗华”推荐阅读【主题策划】猪0.5mL细管冻精不同解冻法精子质量的研究
点击量:0时间:2020-06-29来源:猪业科学

原创 史文清,肖翔等 猪业科学 昨天

 





 

摘要

  利用计算机辅助精子分析系统(CASA)结合顶体完整率(NAR)的检查,研究了长白猪0.5mL细管冻精4种解冻程序后精液的质量,综合评价不同解冻方法。结果表明:1)精子冷冻-解冻后在曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、直线性(LIN)、前向性(STR)、鞭打频率(BCF)以及A+B类精子比例的检测性状上降低,差异极显著(P<0.01);精子头侧摆幅度(ALH)也显著减小(P<0.05),活率(Motilerate)变化差异不显著(P>0.05);2)四组解冻程序中,38℃20s解冻组的活率(Motilerate,MR)、VSL、VCL、STR、A+B精子比例指标均极显著(P<0.01)优于42℃20s、50℃15s、62℃5s解冻组,VAP、LIN与NAR差异不显著(P>0.05);3)Topsis综合评价的结果表38℃20s组在孵育2h、4h、6h之后检测性状优于其他解冻组。由此推论,虽然解冻后精子在运动参数发生较大变化,但是38℃20s的解冻效果优于其他解冻条件。

关键词

计算机辅助精子分析系统;冷冻精液;解冻方法;公猪;Topsis

1  前言

  公猪精液的超低温保存技术,不只是种质资源保存的手段,近几年来猪冷冻精液逐渐成为猪育种生产中重要精液来源,从非洲猪瘟在我国境内暴发以来,冷冻精液的生产与使用愈加得到养猪行业的重视。许多猪场为了育种需要,开始重视猪冷冻精液技术的应用。冷冻精液解冻效果与解冻速度有密切关系,对精子的存活会有显著的影响,目前有研究表明,解冻的温度与时间会影响猪冷冻精液解冻后的效果,不同的解冻液,对猪冷冻精液解冻后的活力与顶体完整率有影响,相同解冻液在不同的解冻方法下也存在差别。0.25mL或者0.5mL细管有较大的表面积-容量比,较适合低温冷冻保存。但是,尚未完全认知的冷冻-解冻过程,还会影响精子完成受精的能力,导致冷冻精液人工授精后母猪的繁殖率较低,窝产仔数较少,难以完全地应用于商品化养猪生产。因此通过计算机辅助精子分析系统(CASA)分析精子活力和运动参数,寻找更优秀的冷冻精液的解冻程序,十分重要。

 

2  材料与方法

2.1  实验材料、药品试剂与仪器

2.1.1  实验材料

  新鲜精液来源于北京S公司商品化常温精液,品种为长白公猪。精液于17℃恒温箱保存,精液采集时间不超过8h。冷冻精液0.5mL细管,品种为纯种长白猪,精液冷冻同批次(批号L135801 20190912)购自北京T公司。

 

2.1.2  试剂

  冷冻精液的解冻剂:同精液来源于同一公司。溶解后26℃下渗透压295mOsm/kg。姬姆萨工作液Giemsa stain(货号G1010,规格100/500mL)购自Solarbio公司。

 

2.1.3  仪器设备

  计算机辅助精子分析仪CASA系统来自日本DIRECT SMAS(型号3.1.10.213);CASA用显微镜为Nikon E200LED,物镜Ph1 BM 10X。计算机HPi5-4590CPU3.30GHz,RAM12.0G。Makler精子计数板:Makler Counting Chamber(无网格CASA专用,腔室10?μL),以色列Sefi?医疗器械公司生产;解冻用水浴锅:数显式电热恒温水箱购自上海某医疗设备公司(型号:HHS),温度控制±0.1℃。CO2培养箱:Thermo371。37.5℃、5%CO2、饱和湿度。17℃恒温箱:北京福意联医疗设备有限公司,温度控制±0.2℃。顶体完整率用倒置OLYMPUS显微镜BX43,OLYMPUS显微CCD DP73获取姬姆萨染色后精子图像。

 

2.2  实验方法

2.2.1  冷冻精液解冻处理

  将解冻液分装放置到超净台内,精液按照4种方法(见表1)解冻后,迅速用棉纱拭干细管表面,用细管剪刀剪开细管,使精液流入到预热37℃的离心管中,内装2mL稀释液,混合后总稀释比为1∶5,混合均匀后,按照分组把精液分装在24孔板(Thermo)中放置到培养箱孵育15min开始检测。

 

2.2.2  CASA分析

  精液解冻后通过CASA评估精子的运动参数,按照世界卫生组织(WHO)人类精液检查与处理实验室手册第五版的要求进行,Makler计数板和CASA计数则遵循仪器使用规范。具体方法:取10?μL?解冻后精液滴加于检测腔室中,置于配备有37.5℃恒温载物台的计算机精液辅助分析仪下,进行精液运动参数评价,检测的指标有:活率(MR,%)、VCL(曲线速度,μm/s)、VSL(直线速度,μm/s)、VAP(平均路径速度,μm/s)、ALH(精子头侧摆幅度,μm/s)、LIN(直线性=VSL/VCL)、STR(前向性=VSL/VAP)、BCF(鞭打频率,次/s)、A类精子比例(标记为红色,运动速度≥15?μm/s)、B类精子比例(标记为绿色,15?μm/s>运动速度≥10?μm/s)、C类精子比例(标记为黄色,10?μm/s>运动速度≥5?μm/s)、D类精子比例(标记为白色,运动速度<5?μm/s)。每个样本检测2次以上,每次检测3个视野以上,计数精子多于1800个。

 

2.2.3  顶体完整率检测

  顶体完整率(Normal Acrosomal Ridge,NAR)采用姬姆萨染色方法评价。取冷冻解冻后的猪精液1滴于载玻片一端,均匀拖布于载玻片上,自然风干。在已风干的载玻片上滴1~2mL中性福尔马林固定液,固定15min后用清水冲去固定液,吹干或自然风干。将固定好的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上,把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间,让其充满平槽并使抹片接触染液,染色1.5h后用清水冲去染液,晾干,在DP73下检测。

 

2.3  实验设计

    1)新鲜精液与冷冻精液对比,找出冷冻精液评价关键指标。新鲜精液从17℃恒温箱取出,取出样本倒入15mL离心管,放到培养箱预热15min开始CASA检测与顶体完整率检测。取38℃水浴20s解冻后的精液倒入15mL离心管,放到培养箱预热15min开始CASA检测与顶体完整率检测。

 

    2)4种解冻方法,CASA检测不同组的运动参数,并由同一人做精子顶体完整性判定。

 

    3)采用topsis综合评价方法,选取差异极显著的VCL、VSL、BCF、A+B比例、NAR共5个指标,等权重设置,分组判断2h、4h、6h的排序情况。

 

2.4  统计方法

  所有数据均采用MICROSOFT EXCEL2013整理,采用统计分析模块中单因素方差分析进行差异性检验,结果表示为平均值±标准差,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。Topsis综合评价也在EXCEL 2013中完成。

 

3  结果与分析

3.1  新鲜精液与冷冻精液的精子运动参数对比

  精子冷冻-解冻后在曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、直线性(LIN)、前向性(STR)、鞭打频率(BCF)以及A+B类精子比例的数值降低,差异极显著(P<0.01);精子头侧摆幅度(ALH)也显著(P<0.05)减小,活率(MR)变化差异不显著(P>0.05);见表2与图1。

3.2  不同组精子的运动参数比较

  不同解冻方法解冻后,在培养箱15min孵育之后精子的7个运动参数与NAR见表3。

  四组解冻组中,38-20解冻组的活率、VSL、VCL、STR、A+B精子比例指标均极显著(P<0.01)优于42-20、50-15、62-5解冻组,38-20解冻组的VAP、LIN、NAR与其他组差异不显著(P>0.05);62-5解冻组的活率、A+B精子比例显著优于42-20解冻组、50-15解冻组(P<0.01),VSL、VCL显著优于42-20解冻组、50-15解冻组(P<0.05)。

 

3.3  不同组精子不同孵育时间的精子质量topsis评价

  四组解冻后的精液在15min、2h、4h、6h分别做CASA与NAR的检测。

 

  38-20组不同时间的NAR的显微照片如图2所示。NAR随着时间的变化,精子发生聚集的现象,NAR有所下降,但是并不显著(P>0.05)。

  Topsis评价结果如下表4。结果表明38-20组在解冻后孵育15min、2h、4h、6h之后优于其他解冻组。孵育15min时,62-5解冻组优于42-20组、50-15组;孵育6h时62-5不及38-20组,但是孵育2h、4h、6h之后50-15组优于62-5组、42-20组。

4  讨论与结论

4.1  超低温冷冻保存以及解冻过程,对猪精子的运动参数影响较大

  猪人工授精技术的实际应用依赖于稳定、高品质的精液来源。目前基本是17℃(或4℃)保存的标准化常温精液,时间与空间的限制较大,难以实现育种效果的较大提升。

 

  超低温冷冻保存技术是猪精液长期保存最有效的方法,虽然猪精液冷冻损伤问题依然是超低温冷冻保存与解冻过程中难以避免的。猪冷冻精液配种1头份的人工授精输精剂量大,需要解冻细管数较多,推高了成本,因此生产上推广步伐缓慢。子宫角输精法(deep uterine insemination,DUI)的技术进步,显著降低了输精量;加上国内子宫内深部输精技术的推广与使用,低剂量深部输精技术推动了猪冷冻精液真正的推广使用。2006年业界对猪冷冻精液的认识是,冷冻解冻后的精液质量较差,受胎率、窝产仔数低于鲜精的生产水平。可喜的是冷冻精液国内生产企业的涌现,2017年获得可以接受的配种妊娠率,每头份冷冻精液细管的价格逐渐被用户接受。

 

4.2  使用CASA分析方法比常规分析方法能够更多度量精子动力参数

  实验用CASA分析得出38℃水浴20s的程序,解冻效果较好。常规精液分析主要依靠检测技师的主观目测,冷冻精液解冻后的活力即显微镜下直线运动精子的百分数,这种检查的准确性受技术人员的水准与人为误差等影响较大。需要专业长时间训练才能够符合生产需求。而且主观目测方法除了死活精子比例与直线运动精子比例,难以得到精子的其他运动参数。CASA分析方法较常规精液分析具有高精确性,可重复性强。精子运动能力是对精子受精能力进行评价的一个重要指标,实验使用的CASA摄像,以每秒60帧的速度,以2592×2048像素清晰度捕获500到2000个精子的频闪状图像,关联四色标记的精子彩色运动轨迹。有报道称,CASA所检测的前向运动精子浓度和运动特征,与体内、体外受精率有显著相关性。精子活率、VAP、VSL、ALH显著影响着总产仔数(P<0.05)。因此有必要采用CASA更客观的方法来评价不同解冻方法后精子质量,对精子的密度、活力等参数直接数量化,为每个精子和种群提供汇总数据。当然,精液的检测时间与稀释浓度以及检测用计数板种类均会影响CASA检测猪精子的准确性。目前国内外对于CASA精子运动能力的参数重视较少。

 

  精子的受精率与精子形态呈正相关,形态正常精子的体外受精率较高,体外受精卵裂率随着精子活力的提高而明显增高。所以在运动参数基础上,该实验结合NAR来预测冻精解冻后受精能力与配种效果。实验使用的商品化冷冻精液,采用0.5mL细管冷冻,推荐的解冻方法是62-5,该冷冻精液的人工授精效果未知。CASA结合NAR检测,38-20的解冻方法最优,该解冻方法是加拿大进口的细管冷冻精液的推荐解冻程序。早期研究也发现,38℃水浴中解冻30s的精子,在39℃培养箱中4h活率仍然高于0.3,优于50℃水浴解冻12s的方法。当然也有不同的结果,认为在37℃ 30s、42℃ 25s、47℃ 20s、52℃ 15s、57℃ 10s和62℃ 5s共6种水浴解冻方法中,最佳解冻方法是57℃ 10s或62℃ 5s,评价指标是解冻精子的活率、质膜完整性、顶体完整性和线粒体膜活性和丙二醛浓度,这就是染色判定为主的方法。因此,究竟哪种解冻方法好,要以人工授精来优化。

 

4.3  结论

  长白猪0.5mL细管冻精,采用CASA分析结合顶体完整率检验发现,解冻后精子在运动参数发生较大变化,四种解冻方法中38℃水浴20s的解冻效果优于其他解冻方法。

 

本文选自《猪业科学》2020年第6期“主题策划”栏目:P58-62(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。阅读更多内容可见网站:http://www.csis.cn。

 

 

 

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